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L’essai de mutation létale dominante a pour but de détecter si certaines substances chimiques engendrent des mutations résultant d’aberrations chromosomiques dans les cellules germinales. En outre, l’essai de mutation létale dominante se prête bien à l’évaluation de la génotoxicité, car, malgré des variations entre les espèces, les facteurs du métabolisme in vivo, la pharmacocinétique et les processus de réparation de l’ADN sont actifs et contribuent aux réponses. L’apparition d’une mutation létale dominante à la suite d’une exposition à un produit chimique d’essai indique que cette substance a affecté le tissu germinal de l’animal étudié. La LD 478 initiale a été adoptée en 1984. La présente version modifiée de cette ligne directrice reflète plus de trente années d’expérience de cet essai et tient compte des possibilités de l’intégrer ou de le combiner à d’autres essais de toxicité, notamment pour le développement, la reproduction ou encore des essais de génotoxicité; cependant, étant donné les limitations de l’essai et le grand nombre d’animaux utilisés, cet essai n’a pas vocation à être utilisé en première intention, mais plutôt comme méthode d’essai supplémentaire quand il n’existe pas d’alternative pour satisfaire les exigences réglementaire.

La présente Ligne directrice porte sur le danger de corrosion cutanée pour la santé humaine faisant suite à une exposition avec un produit chimique. La corrosion cutanée désigne la survenue de lésions irréversibles de la peau qui se manifestent par une nécrose visible, selon la définition du Système Général Harmonisé pour la Classification et l’Étiquetage des produits chimiques.Cette Ligne directrice décrit une procédure in vitro permettant d’identifier les substances et mélanges corrosifs et non corrosifs, en faisant appel à un épiderme humain reconstitué qui reproduit fidèlement les propriétés histologiques, morphologiques, biochimiques et physiologiques des couches supérieures de la peau humaine. La procédure sur épiderme humain reconstitué part du principe que les substances corrosives sont capables de pénétrer dans le stratum corneum (couche cornée) par diffusion ou érosion, et sont cytotoxiques pour les cellules des couches sous-jacentes. Deux réplicats sont employés pour chaque traitement (ou durée d'exposition), et pour les contrôles. Les substances corrosives sont identifiées sur la base de leur capacité à réduire la viabilité cellulaire en dessous des valeurs seuils définies pour des périodes d'exposition spécifiques. La viabilité cellulaire est mesurée via la conversion enzymatique du colorant vital MTT en un sel de formazan bleu mesuré quantitativement après son extraction des tissus. Les substances corrosives sont mises en évidence par leur capacité à faire chuter la viabilité cellulaire sous un seuil prédéterminé.Les produits chimiques colorés et ceux qui interfèrent avec le MTT peuvent également être testés par procédure HPLC.Plusieurs méthodes validées sont référencées dans la Ligne directrice et suivent la procédure décrite ci-dessus. Certaines méthodes référencées permettent par ailleurs la sous-catégorisation des produits corrosifs.

L'essai de micronoyaux de mammifères est employé pour la détection des dommages induits par la substance d'essai aux chromosomes ou à l'appareil mitotique des érythroblastes, par l'analyse des érythrocytes prélevés dans la moelle et/ou les cellules du sang périphérique des animaux, habituellement des rongeurs (souris ou rats). Le but de l'essai de micronoyaux est d'identifier des substances (liquide ou solide) qui causent des lésions cyto-génétiques et des micronoyaux dans lesquels il reste des fragments de chromosomes ou des chromosomes entiers. Une augmentation de la fréquence des érythrocytes polychromatiques micronucléés chez les animaux traités est une indication des dommages chromosomiques induits. Les animaux sont exposés à la substance d'essai par une voie d’exposition appropriée (habituellement par gavage à l'aide d'une sonde gastrique ou d'une canule de tubage adaptée, ou par injection intrapéritonéale). La moelle et/ou les cellules sanguines sont rassemblées, préparées sur des lames et colorées. Les lames sont analysées pour détecter la présence de micronoyaux. Chacun des groupes traités et de contrôle doivent inclure au moins 5 animaux analysables par sexe. L'administration des traitements se compose d'une dose unique de la substance d'essai ou de deux doses quotidiennes (ou plus). La dose limite est 2000 mg/kg pc/j pour le traitement jusqu'à 14 jours, et 1000 mg/kg pc/j pour le traitement de plus de 14 jours.

Cette Ligne directrice décrit une méthode qui estime la toxicité de la substance d’essai sur les espèces de diptères vivant dans le fumier pendant leur période de développement. Deux espèces peuvent être utilisées. La substance testée est mélangée à des matières fécales auxquelles on ajoute soit 10 œufs de Scathophaga stercoraria soit 10 larves de Musca autumnalis. Le test dure jusqu’à 5 jours après l’apparition du dernier adulte dans le témoin (> 18 jours pour S. stercoraria, >13 jours pour M. autumnalis). Les effets éventuels de la substance d’essai sont évalués par les mesures suivantes : le sexe et le nombre total de mouches adultes, la vitesse de développement (indication d’un possible retard) et les changements morphologiques. Selon le schéma expérimental, la concentration sans effet observé (NOEC) ou la concentration pour x% d’effet (ECx) peut être déterminée. Cette Ligne directrice peut être utilisée pour des substances solubles ou pas dans l’eau, mais n’est pas applicable à des substances volatiles. Si la toxicité du produit chimique n’est pas connue, cinq concentrations nominales devraient être testées. Un contrôle positif devrait être effectué régulièrement. Le test est considéré valide, si dans le témoin l’éclosion des larves correspond à plus de 70% des œufs introduits, le nombre d’apparitions d’adultes est ≥ 70% et ≥ 50% des larves respectivement écloses et introduites et si l’apparition des mouches adultes débute après 18 ± 2 jours (S. stercoraria) ou après 13 ± 2 jours (M. autumnalis).

La présente Ligne directrice décrit les procédures à suivre pour évaluer la toxicité orale aiguë de substances chez les oiseaux selon trois types d’essais : (1) essai de dose limite, (2) essai de détermination de la pente de la DL50, (3) essai de détermination de la DL50 seule. Les essais de pente de la DL50 et de DL50 seule sont des procédures d’essai séquentielles. La méthode d’essai choisie dépend du besoin que l’on a ou non de déterminer la dose médiane (DL50) définitive et la pente de la courbe dose-effet. L’essai de dose limite est privilégié en cas de faible toxicité attendue et de létalité improbable à la dose limite. La dose limite, qui doit être adaptée aux fins de l’évaluation, est en général de 2 000 mg/kg de poids corporel. Cinq ou dix oiseaux et un groupe témoin sont utilisés pour l’essai de dose limite. L’essai de détermination de la pente de la DL50 est privilégié lorsque des exigences réglementaires ou d’une autre nature imposent de déterminer, outre une estimation de la DL50, la pente de la courbe dose-effet et/ou l’intervalle de confiance. Il se déroule en 3 ou 4 étapes avec 24 ou 34 oiseaux et un groupe témoin. L’essai de détermination de la DL50 seule est privilégié lorsque des exigences réglementaires ou d’une autre nature imposent de déterminer la dose létale médiane mais non la pente de la courbe dose-effet ni l’intervalle de confiance pour la DL50. Il peut convenir pour estimer un centile de la distribution de la sensibilité d’une espèce et pour fournir des informations aux fins d’étiquetage des produits. Cet essai se déroule en deux étapes, avec 14 oiseaux et un groupe témoin. Logiciel à utiliser pour l'essai 223. Cliquer ici. Logiciel non couvert par l’Acceptation Mutuelle des Données.

Cette Ligne directrice décrit une méthode pour évaluer les effets de substances chimiques dans le sol sur la reproduction de l’espèce d’acariens Hypoaspis (Geolaelaps) aculeifer Canestrini (Acari: Laelapidae). Elle s’applique à des substances solubles dans l’eau ou insolubles, mais pas à des substances volatiles. 28-35 jours après le début de la ponte des œufs, des femelles adultes d’âge similaire sont exposées à un ensemble de concentrations d’une substance d’essai mélangée à 20 g (poids sec) de sol artificiel. Selon la mesure finale (ECx, NOEC ou les deux), cinq à douze concentrations doivent être testées. Il est recommandé de préparer au moins deux à quatre réplicats pour chaque concentration d’essai et six à huit réplicats pour le témoin, chaque réplicat comportant 10 animaux. A 20°C, le test dure 14 jours après l’exposition des femelles, ce qui permet à la progéniture témoin d’atteindre l’étape de deutonymphe. Le nombre de femelles survivantes (pour un test valide, mortalité ≤ 20%) et le nombre de jeunes acariens par récipient (pour un test valide, au moins 50) sont déterminés. La fécondité des acariens exposés à la substance d’essai est comparée à celle des femelles témoins afin de déterminer la ECx (p.ex. EC10, EC50) ou la concentration pour laquelle aucun effet n’est observé (NOEC). Toutes autres différences observées dans le comportement et la morphologie par rapport aux acariens témoins doivent être reportées.

L'essai in vitro de mutation génique sur des cellules de mammifères peut être employé pour détecter des mutations induites par les substances chimiques. Cette Ligne directrice comprend deux essais de mutation génique, avec deux lignées cellulaires spécifiques tk hétérozygotes : les cellules L5178Y tk+/-3.7.2C pour le test du lymphome de souris (mouse lymphoma essai) (MLA), et les cellules TK6 tk+/-   pour l’essai TK6. Les types d’événements génétiques détectés en utilisant le locus tk comprennent soit les mutations géniques que les changements chromosomiques. Des cellules en suspension ou en culture monocouche sont exposées à quatre concentrations analysables de la substance d'essai au moins, avec et sans activation métabolique, pendant une période appropriée. Elles sont repiquées pour déterminer la cytotoxicité et pour permettre l'expression phénotypique avant la sélection. La cytotoxicité est habituellement déterminée en mesurant l'efficacité de clonage relative (survie) ou la croissance totale relative des cultures après la période de traitement. Les cultures traitées sont maintenues dans le milieu de croissance pendant une période suffisante, caractéristique de chaque locus et de chaque type cellulaire, afin de permettre l'expression phénotypique presque optimale des mutations induites. La fréquence de mutant est déterminée par l’ensemencement d’un nombre connu de cellules dans le milieu contenant l'agent sélectif pour détecter des cellules mutantes, et dans le milieu sans agent sélectif pour déterminer l'efficacité de clonage (viabilité). Après un temps approprié d'incubation, des colonies sont comptées.

L'essai d'aberration chromosomique in vivo sur mammifères est employé à l’identification des composés d'essai qui induisent des aberrations structurales dans des cellules de moelle osseuse d’animaux, généralement des rongeurs (rats, souris et hamsters chinois). Les aberrations structurales peuvent être de deux types : chromosomiques ou chromatidiques. Des animaux sont exposés à la substance d'essai (liquide ou solide) par une voie d'exposition appropriée (habituellement par gavage via une sonde gastrique ou d’une canule de tubage appropriée, ou par injection intrapéritonéale) et sont sacrifiés après des délais appropriés de traitement. Avant le sacrifice, les animaux sont traités avec un inhibiteur de fuseau. Des préparations chromosomiques sont alors faites à partir des cellules de moelle et colorées, et des cellules de métaphase sont analysées pour mettre en évidence les aberrations chromosomiques. Chacun des groupes traités et de contrôle doivent inclure au moins 5 animaux analysables par sexe. La dose de limite est 2000 de mg/kg pc/jour pour le traitement jusqu'à 14 jours, et de 1000 mg/kg pc/jour pour le traitement de plus de 14 jours.