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La présente Ligne directrice a donc pour objet l’évaluation des effets d’une exposition prolongée aux produits chimiques sur la reproduction et la survie de l’escargot hermaphrodite d’eau douce Lymnaea stagnalis (grande limnée, ou limnée des étangs). Des adultes reproducteurs sont exposés à une gamme de concentrations du produit chimique testé et l’on observe leur survie et leur reproduction (nombre de grappes d'œufs) pendant 28 jours. Une donnée complémentaire, le nombre d’œufs par grappe, peut également être déterminée. L'accroissement de la longueur de la coquille des adultes peut être mesuré. L’effet toxique du produit chimique testé sur le nombre cumulé de grappes produites par individu-jour est exprimé sous la forme d’une CEx, que l’on établit en appliquant aux données un modèle de régression adapté afin d'estimer la concentration qui produirait une réduction de x % de l'efficacité de reproduction. Il est également possible d’exprimer l’effet toxique du produit chimique testé par la concentration sans effet observé et la concentration minimale avec effet observé (CSEO/CMEO). La CEx et la CSEO/CMEO peuvent être déterminées au cours de la même étude.

Cet essai mesure les aberrations chromosomiques structurales (de type chromosomique et chromatidique) qui surviennent dans les spermatogonies et devrait par conséquent permettre de prévoir l'induction de mutations héritées dans les cellules germinales. L’essai d’aberration chromosomique pratiqué in vivo sur des spermatogonies de mammifères est destiné à détecter les produits chimiques qui causent des aberrations chromosomiques structurales dans les cellules de spermatogonies de mammifère (1) (2) (3). Par ailleurs, cet essai se prête bien à l’évaluation de la génotoxicité, car, malgré des variations entre les espèces, les facteurs du métabolisme in vivo, la pharmacocinétique et les processus de réparation de l’ADN sont actifs et contribuent aux réponses. La Ligne directrice 483 originale a été adoptée en 1997. La présente version modifiée de la ligne directrice reflète les connaissances scientifiques acquises après de nombreuses années d’expérience de cet essai et tient compte des possibilités de l’intégrer ou de le combiner à d’autres études de toxicité ou de génotoxicité.

Le test de reproduction chez l'espèce Potamopyrgus antipodarum (hydrobie des antipodes) a pour objet l’évaluation des effets potentiels d’une exposition prolongée aux produits chimiques sur la reproduction et la survie de lignées parthénogénétiques de cet escargot d’eau douce. À cet effet, on expose des femelles adultes à une gamme de concentrations du produit chimique testé. Le produit chimique testé est mélangé à de l’eau de dilution (eau reconstituée), ajouté aux béchers destinés à l’essai, puis des escargots adultes sont placés dans les béchers. Si l’essai porte sur des « produits chimiques difficiles » (c’est-à-dire volatiles, instables, facilement biodégradables ou adsorbants), il est possible de conduire l’essai en conditions dynamiques, en s’écartant de la conception semi-statique avec renouvellement du milieu à intervalles réguliers. On étudie la survie de P. antipodarum au cours de la période d’exposition de 28 jours, et la reproduction à l’issue des 28 jours d’exposition au produit chimique testé. La reproduction est mesurée par le nombre d'embryons contenus dans la poche embryonnaire (sans distinction du stade de développement) à la fin de la période d'exposition de 28 jours. L’effet toxique du produit chimique testé sur le nombre d’embryons est exprimé sous la forme d’une CEx, établie en appliquant aux données un modèle d’ajustement adapté afin d'estimer la concentration qui produirait une réduction de x % du nombre d’embryons. Il est également possible d’exprimer l’effet toxique du produit testé par la concentration sans effet observé et la concentration minimale avec effet observé (CSEO/CMEO).

La présente ligne directrice décrit les effets d'un produit chimique d’essai sur le fonctionnement de la reproduction chez le mâle et la femelle. Elle a été mise à jour par l'ajout de paramètres relatifs à la détection des perturbateurs endocriniens, en particulier la mesure de la distance ano-génitale et l’examen de la persistance du mamelon chez les petits, ainsi qu'un examen thyroïdien. La substance d’essai est administrée par doses graduées à plusieurs groupes de mâles et de femelles. Les mâles doivent être traités pendant au moins quatre semaines ; les femelles doivent être traitées tout au long de l’étude (approximativement 63 jours). Normalement des accouplements « un mâle pour une femelle » doivent être employés dans cette étude. Cette Ligne directrice utilise le rat. Il est recommandé que la substance d’essai soit administrée oralement par gavage. Ceci devrait être fait avec une dose unique quotidienne en utilisant une sonde gastrique ou une canule d'intubation appropriée. Chaque groupe devrait initialement inclure au moins 10 animaux de chaque sexe. Généralement, au moins trois groupes d'essai et un groupe de contrôle devraient être employés. Des niveaux de dose devraient être choisis, en tenant compte de toutes données de toxicité existantes et de (toxico-) cinétique disponibles. Les résultats de cette étude incluent des observations cliniques, la mesure du poids corporel et la consommation de nourriture/eau, la surveillance du cycle œstral, la mesure/observation des caractéristiques de la descendance, un examen hématologique et de biochimie clinique, de même qu’une autopsie générale et l'histopathologie. Les résultats de cette étude de toxicité devraient être évalués en termes d'effets observés, autopsie et résultats microscopiques. L'évaluation inclura le rapport entre la dose de la substance d'essai et la présence ou l'absence d’observations. En raison de la période courte du traitement du mâle, l'histopathologie du testicule et l'épididyme doivent être pris en compte avec les données de fertilité, lors de l’évaluation des effets reproducteurs mâles.

La présente ligne directrice décrit les effets d'un produit chimique d’essai sur le fonctionnement de la reproduction chez le mâle et la femelle. Elle a été mise à jour par l'ajout de paramètres relatifs à la détection des perturbateurs endocriniens, en particulier la mesure de la distance ano-génitale et l’examen de la persistance du mamelon chez les petits, ainsi qu'un examen thyroïdien. La substance d’essai est administrée en doses graduées à plusieurs groupes de mâles et de femelles. Les mâles doivent être traités pendant un minimum de quatre semaines. Les femelles doivent être traitées tout au long de l’étude, soit approximativement 63 jours. Normalement des accouplements « un mâle pour une femelle » doivent être employés dans cette étude. Cette Ligne directrice utilise le rat. Il est recommandé que chaque groupe commence avec au moins dix animaux de chaque sexe. Généralement, au moins trois groupes d’essai et un groupe contrôle doivent être utilisés. Des niveaux de dose peuvent être basés sur l'information des essais de toxicité aiguë ou sur des résultats d’études à doses répétées. La substance d'essai est administrée oralement et quotidiennement. Les résultats de cette étude incluent des observations cliniques, la mesure du poids corporel et la consommation de nourriture/eau, la surveillance du cycle oestral, la mesure/observation des caractéristiques de la descendance, la mesure du taux sérique d'hormones thyroïdiennes, de même qu’une autopsie générale et l'histopathologie. Les résultats de cette étude de toxicité devraient être évalués en termes d'effets observés, autopsie et résultats microscopiques. En raison de la période courte du traitement du mâle, l'histopathologie du testicule et l'épididyme doivent être pris en compte avec les données de fertilité, lors de l’évaluation des effets reproducteurs mâles.

L’essai in vivo d’électrophorèse sur gel en conditions alcalines de cellules isolées, aussi appelé test des comètes est une méthode mesurant les cassures de brins d’ADN dans les cellules eucaryotes. Chaque groupe traité est composé au minimum de 5 animaux d’un même sexe (ou de chaque sexe si besoin est). On utilise également un groupe témoin positif et un groupe témoin négatif. Les animaux reçoivent un traitement quotidien sur une durée de 2 jours ou plus, permettant au produit chimique d’essai d’atteindre le tissu cible, celui-ci peut être le foie, le rein, ou tous autres tissus si cela est justifié. Les tissus à étudier sont disséqués et des suspensions de cellules/noyaux isolés sont préparées, puis incluses dans un gel d’Agarose pour être fixé sur des lames. Les cellules/noyaux sont traitées avec un tampon de lyse pour éliminer la membrane cellulaire et/ou nucléaire. L’ADN nucléaire dans l’agar est ensuite soumis à une électrophorèse à pH élevé produisant des structures ressemblant à des comètes qui, si l’on utilise les colorants fluorescents appropriés, peuvent être observées par microscopie à fluorescence. En fonction de leur taille les fragments d’ADN migrent de la tête vers la queue de la comète, et l’intensité de la queue de la comète relative à l’intensité totale (tête plus queue) reflète l’ampleur des cassures de l’ADN.

L'essai in vitro de mutation génique sur des cellules de mammifères peut être employé pour détecter des mutations induites par les substances chimiques. Dans cet essai, les systèmes genetiques utilisés permettent de détecter une mutation sur les loci de l’hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase (HPRT) et d’un transgène de la xanthine-guanine phosphoribosyl transferase (XPRT). Les essais de la mutation de HPRT et de XPRT détectent différents types d’événements génétiques. Des cellules en suspension ou en culture monocouche sont exposées à quatre concentrations analysables de la substance d'essai au moins, avec et sans activation métabolique, pendant une période appropriée. Elles sont repiquées pour déterminer la cytotoxicité et pour permettre l'expression phénotypique avant la sélection. La cytotoxicité est habituellement déterminée en mesurant l'efficacité de clonage relative (survie) ou la croissance totale relative des cultures après la période de traitement. Les cultures traitées sont maintenues dans le milieu de croissance pendant une période suffisante, caractéristique de chaque locus et de chaque type cellulaire, afin de permettre l'expression phénotypique presque optimale des mutations induites. La fréquence de mutant est déterminée par l’ensemencement d’un nombre connu de cellules dans le milieu contenant l'agent sélectif pour détecter des cellules mutantes, et dans le milieu sans agent sélectif pour déterminer l'efficacité de clonage (viabilité). Après un temps approprié d'incubation, des colonies sont comptées.

Le but de l'essai in vitro d'aberration chromosomique est d'identifier les agents qui causent des aberrations chromosomiques structurales dans les cellules mammifères cultivées. Les aberrations structurales peuvent être de deux types : chromosomiques ou chromatidiques. L'essai in vitro d'aberration chromosomique peut utiliser des cultures de lignées cellulaires établies, des souches cellulaires ou des cultures de cellules primaires. Des cultures cellulaires sont exposées à la substance d'essai (liquide ou solide) avec et sans activation métabolique pendant environ 1.5 fois le cycle cellulaire normal. Au moins trois concentrations analysables de la substance d'essai devraient être employées. Il faut normalement réaliser les cultures en doublon à chaque niveau de dose. À intervalles prédéterminés après exposition des cultures de cellules à la substance d'essai, les cellules sont traitées avec une substance qui bloque la métaphase, récoltées et teintées. Les cellules métaphasiques sont analysées au microscope pour déceler les aberrations chromosomiques.

Cette Ligne directrice est destinée à évaluer les effets des substances chimiques sur la reproduction des collemboles dans le sol. Folsomia candida,  qui se reproduit par parthénogénèse, est l’espèce recommandée, mais une autre espèce telle que Folsomia Fimetaria, dont la reproduction est sexuée, peut aussi être utilisée si les critères de validité sont remplis. Cette Ligne directrice peut être utilisée pour des substances solubles ou insolubles, mais elle ne s’applique pas aux substances volatiles. L’objectif est de déterminer les effets toxiques de la substance sur la mortalité des adultes et sur le taux de reproduction exprimé respectivement par la CLx et la CEx, ou par les valeurs CSEO/CMEO. Le nombre de concentrations d’essai varie en fonction des effets à mesurer. Pour une approche combinée visant à déterminer les CSEO/CMEO, huit concentrations formant une série géométrique, quatre réplicats pour chaque concentration et huit réplicats témoins sont utilisés. Dans chaque récipient d’essai, 10 juvéniles F. candida (ou 10 males et 10 femelles F. fimetaria) sont placés sur 30 g de sol artificiel modifié OCDE contenant 5 % de matière organique. La durée d’un essai de reproduction définitif est de 4 semaines pour F. candida et de 3 semaines pour F. fimetaria.