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L’Essai de stimulation locale des ganglions lymphatiques: BrdU-ELISA (ELGL: BrdU-ELISA) est une variante non radioactive de la méthode ELGL qui vise à identifier les substances chimiques sensibilisantes et à mesurer la prolifération lymphocytaire qu’ils induisent dans les ganglions lymphatiques auriculaires. Cette méthode décrite chez la souris  se base sur la quantification de la 5-bromo-2- désoxyuridine (BrdU), un analogue of thymidine, dans l’ADN des lymphocytes, comme indicateur de cette prolifération. Quatre animaux au minimum sont employés par groupe de dose, avec au minimum trois concentrations de la substance d'essai, plus un groupe contrôle négatif traité avec le véhicule seul, et un contrôle positif, au besoin. Le protocole expérimental dure 6 jours. Ensuite, les animaux sont euthanasiés et une suspension unicellulaire de cellules de ganglions lymphatiques (CGL) est préparée. La procédure de dispersion des CGL est une étape cruciale, en particulier pour les ganglions lymphocytaires très petits chez le animaux du groupe contrôle négatif. Ensuite la BrdU dans l’ADN des lymphocytes est quantifiée à l’aide d’un kit de dosage ELISA ou par cytométrie de flux (FCM). L’essai inclut des mesures (pesée, BrdU) et des observations cliniques quotidiennes. Les résultats sont exprimés par l’Indice de Stimulation (IS) obtenu par calcul à partir des indices moyens de marquage BrdU pour les différents groupes. Un SI ≥1.6 pour la méthode ELISA ou un SI ≥2.7 pour la cytométrie de flux justifie l’évaluation de la substance d’essai comme sensibilisant potentiel.

La présente Ligne directrice décrit une procédure in vitro permettant l’identification de produits chimiques (substances et mélanges) ne relevant d’aucune classification pour l’irritation oculaire ou les lésions oculaires graves, conformément au SGH de l’ONU. Un modèle d’épithélium cornéen humain reconstitué (EChR) est utilisé, qui reproduit fidèlement les propriétés histologiques, morphologiques, biochimiques et physiologiques de l’épithélium cornéen humain. Le test évalue le danger potentiel qu’un produit chimique testé présente pour l’œil en se fondant sur sa capacité à provoquer une cytotoxicité sur un modèle tissulaire d’EChR, mesurée avec le test MTT. Les produits chimiques colorés et ceux qui interfèrent avec le MTT peuvent également être testés par procédure HPLC.La viabilité du tissu d’EChR après exposition à un produit chimique testé est déterminée par comparaison avec celle de tissus traités avec la substance servant de témoin négatif (% de viabilité) puis utilisée pour prédire le danger potentiel du produit chimique testé pour les yeux. Les produits chimiques qui ne relèvent d’aucune classification dans le SGH de l’ONU sont ceux qui ne provoquent pas une diminution de la viabilité tissulaire en deçà d’un seuil défini (à savoir, viabilité tissulaire > 60 % pour le classement « sans catégorie » du SGH de l’ONU).

La présente Ligne directrice (LD) pour les essais de produits chimiques fondée sur les événements clés porte sur le danger de sensibilisation cutanée pour la santé humaine après une exposition à un produit chimique. La sensibilisation cutanée fait référence à une réponse allergique après un contact avec la peau, selon la définition du Système général harmonisé de classification et d'étiquetage des produits chimiques (SGH) des Nations Unies. Cette LD porte plus particulièrement sur l’activation des cellules dendritiques, qui est un événement clé de la voie toxicologique impliquée dans les effets indésirables (AOP) pour la sensibilisation cutanée. La présente LD décrit quatre méthodes in vitro portant sur le même événement clé : (i) le test d’activation de la lignée cellulaire humaine (h-CLAT), (ii) le test d’activation de la lignée cellulaire U937 (U-SENS), (iii) l’essai par gène rapporteur de l’interleukine 8 (essai IL 8 Luc) et (iv) l’essai de détection génomique rapide des allergènes pour l’évaluation des sensibilisants cutanés (GARD™skin). Les méthodes décrites dans la présente LD permettent de quantifier soit les variations d’expression de marqueurs de surface associés au processus d’activation des monocytes et des DC suite à l’exposition à un sensibilisant (CD54 et CD86, par exemple), soit les changements d’expression de l’IL 8, une cytokine associée à l’activation des DC, soit une série de gènes (signature de marqueurs génomiques) qui sont associés avec le processus d’activation des monocytes et des cellules dendritiques faisant suite à l’exposition à des sensibilisants. Elles sont toutes utilisées pour aider à distinguer les sensibilisants des non-sensibilisants cutanés, selon le SGH.

La présente Ligne directrice fondée sur les événements clés porte sur le danger de sensibilisation cutanée pour la santé humaine faisant suite à une exposition avec un produit chimique. La sensibilisation cutanée fait référence à une réponse allergique après un contact avec la peau, selon la définition du Système général harmonisé de classification et d'étiquetage des produits chimiques (SGH) des Nations Unies. La présente Ligne directrice (LD) est proposée pour l'étude d’un événement clé menant à la sensibilisation cutanée, nommément l’activation des kératinocytes. Ce deuxième événement clé sur la voie toxicologique menant à la sensibilisation cutanée se déroule dans les kératinocytes. Cet événement comprend des réponses inflammatoires et des phénomènes d'expression génique, liés à des voies de signalisation cellulaire spécifiques telles que les voies dépendant de l'élément de réponse antioxydant/électrophile (ARE, Antioxidant Response Element). La présente LD décrit trois méthodes in vitro portant sur le même événement clé : (i) la méthode d’essai ARE-Nrf2 luciférase KeratinoSensTM ; la méthode d’essai ARE-Nrf2 luciférase LuSens ; la méthode d’essai de sensibilisation cutanée EpiSensA. Les méthodes d'essai KeratinoSens et LuSens sont des méthodes in vitro basées sur l’ARE-Nrf2 luciférase et la méthode d’essai EpiSensA est basée sur la quantifiant de l’expression des gènes au moyen de la réaction de PCR quantitative après transcription inverse sur modèle d’épiderme humain reconstitué. Les méthodes proposées sont utilisées pour aider à distinguer les sensibilisants des non-sensibilisants cutanés, selon le SGH.

Cette méthode fournit des informations sur les dangers pour la santé qui peuvent résulter de l’application d’une substance d’essai (solide ou liquide et d’aérosols) sur les yeux. Cette Ligne directrice est utilisée préférablement avec des lapins albinos. La substance d’essai est appliquée en dose unique dans le sac conjonctif d’un œil. L’autre œil, non traité, servira de contrôle. L’essai initial emploie un animal ; le niveau de dose dépend de la nature de la substance à tester. Un essai de confirmation doit être fait si un effet corrosif n’est pas observé lors de l’essai initial, la réponse irritante ou négative doit être confirmée en utilisant deux animaux supplémentaires. Il est recommandé que ce soit fait de manière séquentielle, un animal à la fois, plutôt que d’exposer les deux simultanément. La durée de l’observation doit être suffisante pour évaluer pleinement l’ampleur et la réversibilité des effets observés. Les yeux doivent être observés 1, 24, 48 et 72 heures après l’application. Les scores d'irritation oculaire doivent être évalués en conjonction avec la nature et la sévérité des lésions et leur réversibilité ou leur absence de réversibilité. L’utilisation d’anesthésiques topiques et d’analgésiques systémiques pour réduire ou éviter la douleur et la détresse dans le cadre des essais de sécurité pour l'œil est décrite.

Cette Ligne directrice décrit des essais in vitro d’activation transcriptionnelle faisant intervenir le récepteur à androgène (ARTA) pour la détection de l’activité androgénique agoniste et antagoniste. Ces essais ARTA sont mécanistiquement et fonctionnellement similaires et génèrent des informations sur l’activation transcriptionnelle d’un gène rapporteur suite à la liaison entre le produit chimique testé et le récepteur à androgène. Les lignées cellulaires utilisées dans ces essais expriment le récepteur à androgène et ont été transfectées de façon stable par un gène rapporteur de la luciférase lié à l’activation du récepteur à androgène ; ces lignées cellulaires sont utilisées pour identifier les produits chimiques qui activent (agonistes) ou inhibent (antagonistes) la transcription du récepteur à androgène. Certains produits chimiques peuvent, en fonction du type de lignée cellulaire, montrer à la fois une activité agoniste et antagoniste, et sont connus comme modulateurs sélectifs du récepteur à androgène. Le récepteur à androgène est activé suite à la liaison du produit chimique ; une fois cette liaison établie, le complexe récepteur-ligand subit une translocation vers le noyau où il se fixe à certains éléments de réponse de l’ADN et transactive le gène rapporteur de la luciférase, induisant une augmentation de l’expression cellulaire de l’enzyme luciférase. La luciférine est un substrat transformé par l’enzyme luciférase en produit bioluminescent mesurable quantitativement par un luminomètre. Les systèmes d’essai proposés dans cette Ligne directrice utilisent les lignées cellulaires AR-EcoScreenTM, AR-CALUX®, et 22Rv1/MMTV_GR-KO.

L’essai micronoyau in vitro est un essai de génotoxicité pour la détection des micronoyaux dans le cytoplasme de cellules en interphase. Les micronoyaux peuvent provenir de fragments de chromosomes acentriques (c’est-à-dire sans centromère), ou de chromosomes entiers qui ne peuvent migrer vers les pôles pendant l’étape d’anaphase de la division cellulaire. L’essai détecte l’activité de substances d’essai clastogènes et aneugènes dans les cellules qui ont subi une division cellulaire au cours ou après l’exposition à une substance d’essai. Cette Ligne directrice prévoit l’utilisation de protocoles, avec et sans cytochalasine B (inhibiteur de polymérisation de l’actine). La cytochalasine B permet l’identification et l’analyse sélective de la fréquence des micronoyaux dans les cellules qui ont complété une mitose, ces cellules étant binucléées. La Ligne directrice permet l’utilisation de protocoles sans blocage de la cytokinèse à condition qu’il soit démontré que la population cellulaire a subi une mitose.

Cette Ligne directrice décrit un essai in vitro qui peut être utilisé afin d’identifier des produits hydrosolubles corrosifs et irritants sévères de l’œil de la Catégorie 1 du Système général harmonisé de classification et d’étiquetage (SGH) de l’ONU. L’essai est réalisé dans un puits où une monocouche confluente de cellules Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) sert de séparation entre deux chambres. Il utilise la fluorescéine comme marqueur. La substance d’essai peut détériorer les jonctions des cellules MDCK et donc d’accroître la perméabilité de la monocouche. De ce fait, la fluorescéine passe à travers la monocouche et la fuite de fluorescéine (FL) augmente. La fuite est calculée sous forme d’un pourcentage établi par référence à un contrôle à blanc et à un contrôle de fuite maximum. La concentration de la substance d’essai provoquant 20% de FL (FL20, en mg/mL) est calculée et utilisée comme modèle de prédiction pour l’identification des produits corrosifs et irritants sévères de l’œil. La valeur limite de FL20 permettant de classer les produits chimiques hydrosolubles comme corrosifs/irritants sévères de l’œil est ≤ 100mg/mL. La méthode d’essai par fuite de fluorescéine fait partie de stratégies d’essai étapes.