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Cet essai mesure les aberrations chromosomiques structurales (de type chromosomique et chromatidique) qui surviennent dans les spermatogonies et devrait par conséquent permettre de prévoir l'induction de mutations héritées dans les cellules germinales. L’essai d’aberration chromosomique pratiqué in vivo sur des spermatogonies de mammifères est destiné à détecter les produits chimiques qui causent des aberrations chromosomiques structurales dans les cellules de spermatogonies de mammifère (1) (2) (3). Par ailleurs, cet essai se prête bien à l’évaluation de la génotoxicité, car, malgré des variations entre les espèces, les facteurs du métabolisme in vivo, la pharmacocinétique et les processus de réparation de l’ADN sont actifs et contribuent aux réponses.La Ligne directrice 483 originale a été adoptée en 1997. La présente version modifiée de la ligne directrice reflète les connaissances scientifiques acquises après de nombreuses années d’expérience de cet essai et tient compte des possibilités de l’intégrer ou de le combiner à d’autres études de toxicité ou de génotoxicité.

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 La présente Ligne directrice pour les essais axée sur la performance (LDAP) décrit la méthodologie des essais in vitro de transactivation par transfection stable visant la détection des substances agonistes et antagonistes des récepteurs des œstrogènes (essais de TA ER). Elle comprend des méthodes d’essai structurellement et fonctionnellement similaires pour détecter les substances agonistes et antagonistes des récepteurs des œstrogènes, et devrait faciliter le développement de nouvelles méthodes similaires ou modifiées. La base de la présente LDAP est constituée de deux méthodes d’essai de référence de TA ER. Ces deux méthodes sont les suivantes: essai de TA par transfection stable (essai STTA) faisant appel à la lignée cellulaire hERα-HeLa-9903, dérivée d’une tumeur de col utérin d’origine humaine, et l’essai de TA ER BG1Luc faisant appel à la lignée cellulaire BG-1Luc-4E2, dérivée d’adénocarcinome ovarien d’origine humaine. Les lignées cellulaires utilisées dans ces essais expriment les récepteurs des œstrogènes et ont été transfectées de façon stable avec un gène rapporteur de la luciférase répondant aux ER. Ces essais servent à détecter les substances chimiques qui peuvent activer (activité agoniste) et aussi inhiber (activité antagoniste) la transcription régulée par les ER. Les ER sont activés après liaison du ligand au récepteur Le complexe récepteur-ligand se fixe ensuite à certains éléments de réponse de l’ADN et transactive ainsi le gène rapporteur, induisant une augmentation de l’expression cellulaire d’une enzyme marqueur (par exemple la luciférase dans les sytèmes faisant appel à la luciférase). L’enzyme transforme ensuite son substrat en produit bioluminescent mesurable quantitativement à l’aide d’un luminomètre. Les présentes méthodes sont proposées à des fins de dépistage et de priorisation, mais elles peuvent aussi livrer des informations sur les mécanismes d’action pouvant être utilisées dans le cadre d’une approche fondée sur le poids de la preuve.

Cette Ligne directrice décrit un essai in vitro d’activation transcriptionnelle (TA) faisant intervenir le récepteur des androgènes (AR) humain transfecté de façon stable (ST) pour la détection de l’activité androgénique agoniste et antagoniste des produits chimiques (AR STTA). Cet essai d’activation transcriptionnelle, fondé sur une technique utilisant un gène rapporteur, est un outil in vitro qui fournit des données mécanistiques. Il est utilisé pour déterminer l’activation de signaux ou le blocage du récepteur des androgènes causé par un ligand. Il se peut que certains produits chimiques, selon le type cellulaire, affichent à la fois une activité agoniste et une activité antagoniste et soient connus pour être des modulateurs sélectifs du récepteur des androgènes. Une fois cette liaison établie, le complexe récepteur-ligand subit une translocation vers le noyau où il se fixe à certains éléments de réponse de l’ADN et transactive le gène rapporteur luciférase de luciole, induisant une augmentation de l’expression cellulaire de l’enzyme luciférase. La luciférine est un substrat transformé par l’enzyme luciférase en produit bioluminescent mesurable quantitativement par un luminomètre. Ainsi, l’activité de la luciférase peut être évaluée rapidement et à faible coût à l’aide des nombreux kits d’essai disponibles dans le commerce. Le système d’essai proposé dans cette Ligne directrice utilise la lignée cellulaire AR-EcoScreenTM.

L’essai micronoyau in vitro est un essai de génotoxicité pour la détection des micronoyaux dans le cytoplasme de cellules en interphase. Les micronoyaux peuvent provenir de fragments de chromosomes acentriques (c’est-à-dire sans centromère), ou de chromosomes entiers qui ne peuvent migrer vers les pôles pendant l’étape d’anaphase de la division cellulaire. L’essai détecte l’activité de substances d’essai clastogènes et aneugènes dans les cellules qui ont subi une division cellulaire au cours ou après l’exposition à une substance d’essai. Cette Ligne directrice prévoit l’utilisation de protocoles, avec et sans cytochalasine B (inhibiteur de polymérisation de l’actine). La cytochalasine B permet l’identification et l’analyse sélective de la fréquence des micronoyaux dans les cellules qui ont complété une mitose, ces cellules étant binucléées. La Ligne directrice permet l’utilisation de protocoles sans blocage de la cytokinèse à condition qu’il soit démontré que la population cellulaire a subi une mitose.

Le test de reproduction chez l'espèce Potamopyrgus antipodarum (hydrobie des antipodes) a pour objet l’évaluation des effets potentiels d’une exposition prolongée aux produits chimiques sur la reproduction et la survie de lignées parthénogénétiques de cet escargot d’eau douce. À cet effet, on expose des femelles adultes à une gamme de concentrations du produit chimique testé. Le produit chimique testé est mélangé à de l’eau de dilution (eau reconstituée), ajouté aux béchers destinés à l’essai, puis des escargots adultes sont placés dans les béchers. Si l’essai porte sur des « produits chimiques difficiles » (c’est-à-dire volatiles, instables, facilement biodégradables ou adsorbants), il est possible de conduire l’essai en conditions dynamiques, en s’écartant de la conception semi-statique avec renouvellement du milieu à intervalles réguliers. On étudie la survie de P. antipodarum au cours de la période d’exposition de 28 jours, et la reproduction à l’issue des 28 jours d’exposition au produit chimique testé. La reproduction est mesurée par le nombre d'embryons contenus dans la poche embryonnaire (sans distinction du stade de développement) à la fin de la période d'exposition de 28 jours. L’effet toxique du produit chimique testé sur le nombre d’embryons est exprimé sous la forme d’une CEx, établie en appliquant aux données un modèle d’ajustement adapté afin d'estimer la concentration qui produirait une réduction de x % du nombre d’embryons. Il est également possible d’exprimer l’effet toxique du produit testé par la concentration sans effet observé et la concentration minimale avec effet observé (CSEO/CMEO).

L’essai in vivo d’électrophorèse sur gel en conditions alcalines de cellules isolées, aussi appelé test des comètes est une méthode mesurant les cassures de brins d’ADN dans les cellules eucaryotes.Chaque groupe traité est composé au minimum de 5 animaux d’un même sexe (ou de chaque sexe si besoin est). On utilise également un groupe témoin positif et un groupe témoin négatif. Les animaux reçoivent un traitement quotidien sur une durée de 2 jours ou plus, permettant au produit chimique d’essai d’atteindre le tissu cible, celui-ci peut être le foie, le rein, ou tous autres tissus si cela est justifié.Les tissus à étudier sont disséqués et des suspensions de cellules/noyaux isolés sont préparées, puis incluses dans un gel d’Agarose pour être fixé sur des lames. Les cellules/noyaux sont traitées avec un tampon de lyse pour éliminer la membrane cellulaire et/ou nucléaire. L’ADN nucléaire dans l’agar est ensuite soumis à une électrophorèse à pH élevé produisant des structures ressemblant à des comètes qui, si l’on utilise les colorants fluorescents appropriés, peuvent être observées par microscopie à fluorescence. En fonction de leur taille les fragments d’ADN migrent de la tête vers la queue de la comète, et l’intensité de la queue de la comète relative à l’intensité totale (tête plus queue) reflète l’ampleur des cassures de l’ADN.

L'essai in vitro de mutation génique sur des cellules de mammifères peut être employé pour détecter des mutations induites par les substances chimiques. Dans cet essai, les systèmes genetiques utilisés permettent de détecter une mutation sur les loci de l’hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase (HPRT) et d’un transgène de la xanthine-guanine phosphoribosyl transferase (XPRT). Les essais de la mutation de HPRT et de XPRT détectent différents types d’événements génétiques.Des cellules en suspension ou en culture monocouche sont exposées à quatre concentrations analysables de la substance d'essai au moins, avec et sans activation métabolique, pendant une période appropriée. Elles sont repiquées pour déterminer la cytotoxicité et pour permettre l'expression phénotypique avant la sélection. La cytotoxicité est habituellement déterminée en mesurant l'efficacité de clonage relative (survie) ou la croissance totale relative des cultures après la période de traitement. Les cultures traitées sont maintenues dans le milieu de croissance pendant une période suffisante, caractéristique de chaque locus et de chaque type cellulaire, afin de permettre l'expression phénotypique presque optimale des mutations induites. La fréquence de mutant est déterminée par l’ensemencement d’un nombre connu de cellules dans le milieu contenant l'agent sélectif pour détecter des cellules mutantes, et dans le milieu sans agent sélectif pour déterminer l'efficacité de clonage (viabilité). Après un temps approprié d'incubation, des colonies sont comptées.

Cette Ligne directrice est destinée à évaluer les effets des substances chimiques sur la reproduction des collemboles dans le sol. Folsomia candida,  qui se reproduit par parthénogénèse, est l’espèce recommandée, mais une autre espèce telle que Folsomia Fimetaria, dont la reproduction est sexuée, peut aussi être utilisée si les critères de validité sont remplis. Cette Ligne directrice peut être utilisée pour des substances solubles ou insolubles, mais elle ne s’applique pas aux substances volatiles. L’objectif est de déterminer les effets toxiques de la substance sur la mortalité des adultes et sur le taux de reproduction exprimé respectivement par la CLx et la CEx, ou par les valeurs CSEO/CMEO. Le nombre de concentrations d’essai varie en fonction des effets à mesurer. Pour une approche combinée visant à déterminer les CSEO/CMEO, huit concentrations formant une série géométrique, quatre réplicats pour chaque concentration et huit réplicats témoins sont utilisés. Dans chaque récipient d’essai, 10 juvéniles F. candida (ou 10 males et 10 femelles F. fimetaria) sont placés sur 30 g de sol artificiel modifié OCDE contenant 5 % de matière organique. La durée d’un essai de reproduction définitif est de 4 semaines pour F. candida et de 3 semaines pour F. fimetaria.

L'essai de micronoyaux de mammifères est employé pour la détection des dommages induits par la substance d'essai aux chromosomes ou à l'appareil mitotique des érythroblastes, par l'analyse des érythrocytes prélevés dans la moelle et/ou les cellules du sang périphérique des animaux, habituellement des rongeurs (souris ou rats).Le but de l'essai de micronoyaux est d'identifier des substances (liquide ou solide) qui causent des lésions cyto-génétiques et des micronoyaux dans lesquels il reste des fragments de chromosomes ou des chromosomes entiers. Une augmentation de la fréquence des érythrocytes polychromatiques micronucléés chez les animaux traités est une indication des dommages chromosomiques induits. Les animaux sont exposés à la substance d'essai par une voie d’exposition appropriée (habituellement par gavage à l'aide d'une sonde gastrique ou d'une canule de tubage adaptée, ou par injection intrapéritonéale). La moelle et/ou les cellules sanguines sont rassemblées, préparées sur des lames et colorées. Les lames sont analysées pour détecter la présence de micronoyaux. Chacun des groupes traités et de contrôle doivent inclure au moins 5 animaux analysables par sexe. L'administration des traitements se compose d'une dose unique de la substance d'essai ou de deux doses quotidiennes (ou plus). La dose limite est 2000 mg/kg pc/j pour le traitement jusqu'à 14 jours, et 1000 mg/kg pc/j pour le traitement de plus de 14 jours.

Cette Ligne directrice décrit une méthode qui estime la toxicité de la substance d’essai sur les espèces de diptères vivant dans le fumier pendant leur période de développement. Deux espèces peuvent être utilisées. La substance testée est mélangée à des matières fécales auxquelles on ajoute soit 10 œufs de Scathophaga stercoraria soit 10 larves de Musca autumnalis. Le test dure jusqu’à 5 jours après l’apparition du dernier adulte dans le témoin (> 18 jours pour S. stercoraria, >13 jours pour M. autumnalis). Les effets éventuels de la substance d’essai sont évalués par les mesures suivantes : le sexe et le nombre total de mouches adultes, la vitesse de développement (indication d’un possible retard) et les changements morphologiques. Selon le schéma expérimental, la concentration sans effet observé (NOEC) ou la concentration pour x% d’effet (ECx) peut être déterminée. Cette Ligne directrice peut être utilisée pour des substances solubles ou pas dans l’eau, mais n’est pas applicable à des substances volatiles. Si la toxicité du produit chimique n’est pas connue, cinq concentrations nominales devraient être testées. Un contrôle positif devrait être effectué régulièrement. Le test est considéré valide, si dans le témoin l’éclosion des larves correspond à plus de 70% des œufs introduits, le nombre d’apparitions d’adultes est ≥ 70% et ≥ 50% des larves respectivement écloses et introduites et si l’apparition des mouches adultes débute après 18 ± 2 jours (S. stercoraria) ou après 13 ± 2 jours (M. autumnalis).