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La présente ligne directrice décrit les effets d'un produit chimique d’essai sur le fonctionnement de la reproduction chez le mâle et la femelle. Elle a été mise à jour par l'ajout de paramètres relatifs à la détection des perturbateurs endocriniens, en particulier la mesure de la distance ano-génitale et l’examen de la persistance du mamelon chez les petits, ainsi qu'un examen thyroïdien. La substance d’essai est administrée par doses graduées à plusieurs groupes de mâles et de femelles. Les mâles doivent être traités pendant au moins quatre semaines ; les femelles doivent être traitées tout au long de l’étude (approximativement 63 jours). Normalement des accouplements « un mâle pour une femelle » doivent être employés dans cette étude. Cette Ligne directrice utilise le rat. Il est recommandé que la substance d’essai soit administrée oralement par gavage. Ceci devrait être fait avec une dose unique quotidienne en utilisant une sonde gastrique ou une canule d'intubation appropriée. Chaque groupe devrait initialement inclure au moins 10 animaux de chaque sexe. Généralement, au moins trois groupes d'essai et un groupe de contrôle devraient être employés. Des niveaux de dose devraient être choisis, en tenant compte de toutes données de toxicité existantes et de (toxico-) cinétique disponibles. Les résultats de cette étude incluent des observations cliniques, la mesure du poids corporel et la consommation de nourriture/eau, la surveillance du cycle œstral, la mesure/observation des caractéristiques de la descendance, un examen hématologique et de biochimie clinique, de même qu’une autopsie générale et l'histopathologie. Les résultats de cette étude de toxicité devraient être évalués en termes d'effets observés, autopsie et résultats microscopiques. L'évaluation inclura le rapport entre la dose de la substance d'essai et la présence ou l'absence d’observations. En raison de la période courte du traitement du mâle, l'histopathologie du testicule et l'épididyme doivent être pris en compte avec les données de fertilité, lors de l’évaluation des effets reproducteurs mâles.

La présente Ligne directrice pour les essais axée sur la performance (LDAP) décrit la méthodologie des essais in vitro  faisant appel au récepteur d’œstrogène recombinant humain pour la détection des substances ayant une affinité de liaison avec les récepteurs des œstrogènes (essais de liaison au hrER). Elle comprend deux méthodes d’essai structurellement et fonctionnellement similaires pour détecter les ligands des récepteurs des œstrogènes (ERα), et doit faciliter l’élaboration de nouvelles méthodes similaires ou modifiées. La base de la présente LDAP est constituée de deux méthodes d’essai de référence. Ces deux méthodes sont les suivantes: l'essai de Freyberger-Wilson (FW), essai in vitro de liaison aux ER à l’aide d’un ERα humain intégral et l'essai du Chemical Evaluation and Research Institute (CERI), essai in vitro de liaison aux ER à l’aide du domaine de liaison du ligand d’un ER recombinant humain. Cet essai consiste principalement à mesurer la capacité d’un ligand radiomarqué (le [3H]-17β-œstradiol) à se lier aux ER en présence de concentrations croissantes du produit chimique testé (appelé « compétiteur »). Les produits chimiques d’essai qui présentent une forte affinité de liaison avec les ER entrent en concurrence avec le ligand radiomarqué à une concentration plus faible que les composés ayant une affinité moindre vis-à-vis du récepteur. L’essai comporte deux grands éléments : une expérience de liaison à saturation pour établir les paramètres de l’interaction récepteur-ligand et documenter la spécificité des liaisons aux ER, puis une expérience de liaison compétitive visant à déterminer dans quelle mesure un produit chimique testé fait concurrence à un ligand radiomarqué pour se fixer aux ER. Les présentes méthodes sont proposées à des fins de dépistage et de priorisation, mais elles peuvent aussi livrer des informations sur les mécanismes d’action pouvant être utilisées dans le cadre d’une approche fondée sur le poids de la preuve.

La présente Ligne directrice porte sur le danger de sensibilisation cutanée pour la santé humaine faisant suite à une exposition avec un produit chimique. La sensibilisation cutanée se réfère à une réponse allergique faisant suite à un contact avec la peau, selon la définition du Système général harmonisé de classification et d'étiquetage des produits chimiques (SGH) des Nations Unies.La méthode in chemico décrite dans la présente Ligne directrice, à savoir l’essai de réactivité peptidique directe (Direct Peptide Reactivity Assay, DPRA), doit aider à distinguer les sensibilisants des non-sensibilisants cutanés.Le DPRA est proposé pour l'étude de l'événement moléculaire initiateur menant aux effets néfastes de sensibilisation cutanée, nommément la réactivité protéique, par quantification de la réactivité des produits chimiques testés vis-à-vis de modèles peptidiques de synthèse contenant soit de la lysine, soit de la cystéine. Les taux de déplétion de la cystéine et de la lysine sont ensuite calculés et utilisés dans un modèle de prédiction pour classer les substances dans l'une des quatre classes de réactivité, afin d’aider à distinguer les sensibilisants des non-sensibilisants cutanés.

L'essai de micronoyaux de mammifères est employé pour la détection des dommages induits par la substance d'essai aux chromosomes ou à l'appareil mitotique des érythroblastes, par l'analyse des érythrocytes prélevés dans la moelle et/ou les cellules du sang périphérique des animaux, habituellement des rongeurs (souris ou rats). Le but de l'essai de micronoyaux est d'identifier des substances (liquide ou solide) qui causent des lésions cyto-génétiques et des micronoyaux dans lesquels il reste des fragments de chromosomes ou des chromosomes entiers. Une augmentation de la fréquence des érythrocytes polychromatiques micronucléés chez les animaux traités est une indication des dommages chromosomiques induits. Les animaux sont exposés à la substance d'essai par une voie d’exposition appropriée (habituellement par gavage à l'aide d'une sonde gastrique ou d'une canule de tubage adaptée, ou par injection intrapéritonéale). La moelle et/ou les cellules sanguines sont rassemblées, préparées sur des lames et colorées. Les lames sont analysées pour détecter la présence de micronoyaux. Chacun des groupes traités et de contrôle doivent inclure au moins 5 animaux analysables par sexe. L'administration des traitements se compose d'une dose unique de la substance d'essai ou de deux doses quotidiennes (ou plus). La dose limite est 2000 mg/kg pc/j pour le traitement jusqu'à 14 jours, et 1000 mg/kg pc/j pour le traitement de plus de 14 jours.

L'essai d'aberration chromosomique in vivo sur mammifères est employé à l’identification des composés d'essai qui induisent des aberrations structurales dans des cellules de moelle osseuse d’animaux, généralement des rongeurs (rats, souris et hamsters chinois). Les aberrations structurales peuvent être de deux types : chromosomiques ou chromatidiques. Des animaux sont exposés à la substance d'essai (liquide ou solide) par une voie d'exposition appropriée (habituellement par gavage via une sonde gastrique ou d’une canule de tubage appropriée, ou par injection intrapéritonéale) et sont sacrifiés après des délais appropriés de traitement. Avant le sacrifice, les animaux sont traités avec un inhibiteur de fuseau. Des préparations chromosomiques sont alors faites à partir des cellules de moelle et colorées, et des cellules de métaphase sont analysées pour mettre en évidence les aberrations chromosomiques. Chacun des groupes traités et de contrôle doivent inclure au moins 5 animaux analysables par sexe. La dose de limite est 2000 de mg/kg pc/jour pour le traitement jusqu'à 14 jours, et de 1000 mg/kg pc/jour pour le traitement de plus de 14 jours.

Le but de l'essai in vitro d'aberration chromosomique est d'identifier les agents qui causent des aberrations chromosomiques structurales dans les cellules mammifères cultivées. Les aberrations structurales peuvent être de deux types : chromosomiques ou chromatidiques. L'essai in vitro d'aberration chromosomique peut utiliser des cultures de lignées cellulaires établies, des souches cellulaires ou des cultures de cellules primaires. Des cultures cellulaires sont exposées à la substance d'essai (liquide ou solide) avec et sans activation métabolique pendant environ 1.5 fois le cycle cellulaire normal. Au moins trois concentrations analysables de la substance d'essai devraient être employées. Il faut normalement réaliser les cultures en doublon à chaque niveau de dose. À intervalles prédéterminés après exposition des cultures de cellules à la substance d'essai, les cellules sont traitées avec une substance qui bloque la métaphase, récoltées et teintées. Les cellules métaphasiques sont analysées au microscope pour déceler les aberrations chromosomiques.

This document is a tool to support regulatory authorities’ decisions on the hazard of specific chemicals when they receive test results from a Test Guideline (TG) or draft TG for the screening/testing of chemicals for endocrine disrupting properties. The contexts for these decisions will vary, depending on local legislation and practice, so the advice is worded in such a way as to permit flexible interpretation. It provides guidance on how to interpret the outcome of individual tests and how to increase evidence on whether or not a substance may be an endocrine disrupter; to this end, it recommends a test method that may be performed if regulatory authorities need more evidence.