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L’essai micronoyau in vitro est un essai de génotoxicité pour la détection des micronoyaux dans le cytoplasme de cellules en interphase. Les micronoyaux peuvent provenir de fragments de chromosomes acentriques (c’est-à-dire sans centromère), ou de chromosomes entiers qui ne peuvent migrer vers les pôles pendant l’étape d’anaphase de la division cellulaire. L’essai détecte l’activité de substances d’essai clastogènes et aneugènes dans les cellules qui ont subi une division cellulaire au cours ou après l’exposition à une substance d’essai. Cette Ligne directrice prévoit l’utilisation de protocoles, avec et sans cytochalasine B (inhibiteur de polymérisation de l’actine). La cytochalasine B permet l’identification et l’analyse sélective de la fréquence des micronoyaux dans les cellules qui ont complété une mitose, ces cellules étant binucléées. La Ligne directrice permet l’utilisation de protocoles sans blocage de la cytokinèse à condition qu’il soit démontré que la population cellulaire a subi une mitose.

Cette méthode fournit des informations sur les dangers pour la santé qui peuvent résulter de l’application d’une substance d’essai (solide ou liquide et d’aérosols) sur les yeux. Cette Ligne directrice est utilisée préférablement avec des lapins albinos. La substance d’essai est appliquée en dose unique dans le sac conjonctif d’un œil. L’autre œil, non traité, servira de contrôle. L’essai initial emploie un animal ; le niveau de dose dépend de la nature de la substance à tester. Un essai de confirmation doit être fait si un effet corrosif n’est pas observé lors de l’essai initial, la réponse irritante ou négative doit être confirmée en utilisant deux animaux supplémentaires. Il est recommandé que ce soit fait de manière séquentielle, un animal à la fois, plutôt que d’exposer les deux simultanément. La durée de l’observation doit être suffisante pour évaluer pleinement l’ampleur et la réversibilité des effets observés. Les yeux doivent être observés 1, 24, 48 et 72 heures après l’application. Les scores d'irritation oculaire doivent être évalués en conjonction avec la nature et la sévérité des lésions et leur réversibilité ou leur absence de réversibilité. L’utilisation d’anesthésiques topiques et d’analgésiques systémiques pour réduire ou éviter la douleur et la détresse dans le cadre des essais de sécurité pour l'œil est décrite.

Cette Ligne directrice décrit un test d’exposition de courte durée in vitro de cytotoxicité, réalisé sur une monocouche confluente de fibroblastes de cornée de lapin du Statens Seruminstitut (SIRC), cultivés sur des plaques microtitres 96 puits. Après 5 minutes d’exposition à un produit chimique testé, on détermine quantitativement la cytotoxicité en mesurant, à l’aide du test MTT, la viabilité relative des cellules SIRC. L’observation d’une diminution de la viabilité cellulaire est utilisée pour prédire les effets indésirables potentiels pouvant provoquer des lésions oculaires. La viabilité cellulaire est évaluée par un dosage quantitatif des cristaux de formazan bleu extraits des cellules et produits par les cellules vivantes lors de la conversion enzymatique du colorant vital MTT, encore appelé Bleu de thiazol. La viabilité cellulaire observée est comparée à celle du témoin avec solvant (viabilité relative) et utilisée comme estimation du danger potentiel pour les yeux que présente le produit chimique testé. Les produits chimiques testés sont classés dans la catégorie 1 du SGH de l’ONU lorsqu’une viabilité cellulaire inférieure ou égale à (≤) 70% est observée aux deux concentrations testées (5 % et 0.05 %). À l’inverse, les produits chimiques pour lesquels la viabilité cellulaire est supérieure à (>) 70 % aux deux concentrations testées (5 % et 0.05 %) sont classés « sans catégorie » selon le système SGH.

La présente Ligne directrice (LD) pour les essais de produits chimiques fondée sur les événements clés porte sur le danger de sensibilisation cutanée pour la santé humaine faisant suite à une exposition avec un produit chimique. Elle porte plus particulièrement sur l’activation des cellules dendritiques, qui est un événement clé de la voie toxicologique impliquée dans les effets indésirables (AOP) pour la sensibilisation cutanée. La sensibilisation cutanée se réfère à une réponse allergique faisant suite à un contact avec la peau, selon la définition du Système général harmonisé de classification et d'étiquetage des produits chimiques (SGH) des Nations Unies. La présente LD décrit trois méthodes in vitro portant sur le même événement clé : (i) le test d’activation de la lignée cellulaire humaine (h-CLAT), (ii) le test d’activation de la lignée cellulaire U937 (U-SENS) et (iii) l’essai par gène rapporteur de l’interleukine 8 (essai IL‑8 Luc). Ils sont tous utilisés pour aider à distinguer les sensibilisants des non-sensibilisants cutanés, selon le SGH. Les méthodes décrites dans la présente LD permettent de quantifier soit les variations d’expression de marqueurs de surface associés au processus d’activation des monocytes et des DC suite à l’exposition à un sensibilisant (CD54 et CD86, par exemple), soit les changements d’expression de l’IL‑8, une cytokine associée à l’activation des DC. Dans les essais h-CLAT et U-SENS, la variation d’expression des marqueurs de surface est mesurée par cytométrie en flux après coloration cellulaire avec des anticorps marqués par fluorochrome. Dans l’essai IL-8 Luc, la variation d’expression de IL-8 est mesurée de façon indirecte via l’activité du gène de la luciférase qui se trouve sous contrôle du promoteur IL-8. L’intensité relative de fluorescence ou luminescence des cellules traitées, comparée à celle du témoin de solvant/véhicule, est calculée et utilisée dans un modèle prédictif, pour aider à distinguer les sensibilisants des non-sensibilisants.

Cette Ligne directrice décrit un essai in vitro qui peut être utilisé afin d’identifier des produits hydrosolubles corrosifs et irritants sévères de l’œil de la Catégorie 1 du Système général harmonisé de classification et d’étiquetage (SGH) de l’ONU. L’essai est réalisé dans un puits où une monocouche confluente de cellules Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) sert de séparation entre deux chambres. Il utilise la fluorescéine comme marqueur. La substance d’essai peut détériorer les jonctions des cellules MDCK et donc d’accroître la perméabilité de la monocouche. De ce fait, la fluorescéine passe à travers la monocouche et la fuite de fluorescéine (FL) augmente. La fuite est calculée sous forme d’un pourcentage établi par référence à un contrôle à blanc et à un contrôle de fuite maximum. La concentration de la substance d’essai provoquant 20% de FL (FL20, en mg/mL) est calculée et utilisée comme modèle de prédiction pour l’identification des produits corrosifs et irritants sévères de l’œil. La valeur limite de FL20 permettant de classer les produits chimiques hydrosolubles comme corrosifs/irritants sévères de l’œil est ≤ 100mg/mL. La méthode d’essai par fuite de fluorescéine fait partie de stratégies d’essai étapes.